Gibt es versteckte Gene in DNA/RNA-Impfstoffen?
Christopher A. Beaudoin 1 , Martin Bartas 2 , Adriana Volná 3 , Petr Pečinka 2 und Tom L. Blundell 1*

1 Department of Biochemistry, Sanger Building, University of Cambridge, Cambridge, Vereinigtes Königreich
2 Institut für Biologie und Ökologie, Universität Ostrava, Ostrava, Tschechien
3 Institut für Physik, Universität Ostrava, Ostrava, Tschechien

Aufgrund der schnellen weltweiten Verbreitung des Coronavirus – 2 (SARS-CoV-2) mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom werden Präventions- und Behandlungsoptionen dringend benötigt, um die infektionsbedingte Morbidität, Mortalität und wirtschaftlichen Verluste zu kontrollieren. Obwohl die Entwicklung von Arzneimitteln und inaktivierten und abgeschwächten Virusimpfstoffen viel Zeit und Ressourcen erfordern kann, bieten DNA- und RNA-Impfstoffe eine schnelle, einfache und kostengünstige Behandlungsalternative, selbst wenn sie in großem Maßstab hergestellt werden. Das Spike-Protein, das sich als das antigeneste SARS-CoV-2-Protein erwiesen hat, wurde weithin als Ziel der Wahl für DNA/RNA-Impfstoffe ausgewählt. Impfkampagnen haben hohe Impfraten und hohen Schutz gemeldet, aber zahlreiche unbeabsichtigte Wirkungen, die von Muskelschmerzen bis zum Tod reichen, haben zu Bedenken hinsichtlich der Sicherheit von RNA/DNA-Impfstoffen geführt. Parallel zu diesen Studien Es wurde festgestellt, dass mehrere offene Leserahmen (ORFs) akzessorische SARS-CoV-2-Gene überlappen, von denen zwei, ORF2b und ORF-Sh, die Spike-Proteinsequenz überlappen. Daher könnte das Vorhandensein dieser und möglicherweise anderer ORFs auf SARS-CoV-2-DNA/RNA-Impfstoffen zur Translation unerwünschter Proteine ​​während der Impfung führen. Hier diskutieren wir die Translation von überlappenden Genen im Zusammenhang mit DNA/RNA-Impfstoffen. Zwei öffentlich zugänglich gemachte mRNA-Impfstoff-Spike-Proteinsequenzen wurden mit der Wildtyp-Sequenz verglichen, um mögliche Unterschiede in mutmaßlich überlappenden ORFs aufzudecken. Insbesondere wird vorhergesagt, dass die mRNA-1273-Impfstoffsequenz von Moderna keine rahmenverschobenen ORFs auf dem positiven Sense-Strang enthält, was den Nutzen der Codon-Optimierung beim DNA/RNA-Impfstoffdesign zur Entfernung unerwünschter überlappender ORFs unterstreicht. Da nur wenige Informationen über ORF2b oder ORF-Sh verfügbar sind, verwenden wir strukturelle Bioinformatiktechniken, um die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Proteine ​​zu untersuchen. Das Vorhandensein mutmaßlicher ORFs auf DNA/RNA-Impfstoffkandidaten impliziert, dass überlappende Gene zur Translation kleinerer Peptide beitragen können, was möglicherweise zu unbeabsichtigten klinischen Ergebnissen führt, und dass das proteinkodierende Potenzial von DNA/RNA-Impfstoffen vor der Verabreichung rigoros untersucht werden sollte .

Einführung

Das Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn, das erstmals Ende 2019 beschrieben wurde ( 1 ). SARS-CoV-2 ist phylogenetisch mit dem Erreger der SARS-CoV-Epidemie von 2002 verwandt und verursacht viele der gleichen Symptome wie Fieber und Myalgie ( 2 ). Aufgrund der hohen Übertragbarkeit von SARS-CoV-2 und der schnellen weltweiten Verbreitung erklärte die Weltgesundheitsorganisation den weltweiten Ausbruch bis März 2020 zur COVID-19-Pandemie ( 3 ). Die durch die Pandemie eingetretenen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Einbußen führten zur Priorisierung von Präventions- und Behandlungsoptionen mit dem schnellsten Weg zur sicheren klinischen Anwendung ( 4). Obwohl niedermolekulare Inhibitoren und inaktivierte oder attenuierte Lebendimpfstoffkandidaten verwendet wurden, um Infektionen durch pathogene Viren erfolgreich zu behandeln, können die Pipelines, um diese Produkte in die klinische Anwendung zu bringen, viel Zeit und Ressourcen mit potenziell niedrigen Erfolgsraten erfordern ( 5 , 6 ). Unter den in den letzten Jahren entwickelten neuartigen Plattformen zur Verabreichung von Impfstoffen sind jedoch DNA- und RNA-Impfstoffe interessant geworden, da sie das Potenzial haben, kostengünstig und schnell in großem Maßstab hergestellt zu werden ( 7). Nur die Nukleotidsequenz des ausgewählten antigenen Proteins ist erforderlich, um mit der Produktion zu beginnen, die aus der DNA/RNA-Sequenzierung des Virus abgeleitet werden kann. Daher wurden DNA/RNA-Impfstoffe als Hauptkandidaten zur Eindämmung der COVID-19-Übertragung vorgeschlagen.

Das SARS-CoV-2-Genom kodiert für mindestens 30 Proteine, von denen drei auf der Virionoberfläche exponiert sind und vom Immunsystem erkannt werden können ( 8 – 10 ). Das Spike-Protein ist ein großes trimeres Glykoprotein (1.273 Aminosäuren lange Protomere), das aus der Virionoberfläche herausragt, um an Zelloberflächenrezeptoren auf Wirtszellen zu binden, wie Angiotensin-Converting-Enzym II (ACE2), um den Viruseintritt einzuleiten ( 11 ) . . Die große Oberfläche des Spike-Proteins und seine Rolle beim Eintritt in die Wirtszelle machen es attraktiv als Ziel für das Immunsystem und klinische Behandlungen wie Medikamente und therapeutische Antikörper ( 12 ). Bemerkenswert ist, dass das Spike-Protein stark glykosyliert ist, was dazu beiträgt, das Virus vor Wechselwirkungen mit Antikörpern zu schützen (13 ). Die Region mit dem niedrigsten Glykosylierungsgrad ist die Rezeptorbindungsdomäne, die an Oberflächenproteine ​​der Wirtszelle bindet, um den viralen Eintritt zu initiieren, und die infolgedessen die antigeneste Region des Spike-Proteins ist ( 14 ). Die anderen beiden auf der Virionoberfläche exponierten Proteine, die Hüll- und Membranproteine, stehen ebenfalls zur Verwendung als Antigen-Targets zur Verfügung; sie sind jedoch kleiner und für Protein-Protein-Wechselwirkungen weniger zugänglich als das Spike-Protein. Aufgrund der Beweise dafür, dass Spike das am besten geeignete antigene Ziel für SARS-CoV-2 ist, wurde es häufig in Impfstoffversuchen verwendet.

Zahlreiche Unternehmen und akademische Einrichtungen auf der ganzen Welt haben DNA/RNA-Impfstoffe für das SARS-CoV-2-Spike-Protein entwickelt oder entwickeln dies derzeit ( 15 ). Im Allgemeinen wird im Fall von DNA-Impfstoffen die DNA-Sequenz des SARS-CoV-2-Spike-Proteins in voller Länge in ein Plasmid eingefügt, und zusätzliche Technologien wie Elektroporation können dazu beitragen, die Transfektion effizienter zu machen ( 16 , 17). Die in die menschliche Zelle transfizierte Spike-Protein-DNA kann dann transkribiert und translatiert werden, um das trimere Spike-Protein zu erzeugen, das sich dann zur posttranslationalen Modifikation (z. B. Signalsequenzspaltung, Glykosylierung) zum endoplasmatischen Retikulum und zum Golgi-Apparat bewegt und dort weiterläuft der sekretorische Weg, um an der Zellmembran verankert zu werden, um dem Immunsystem ausgesetzt zu werden ( 18 , 19 )⁠. Die RNA-basierten Impfstoffformulierungen umfassen Lipid-Nanopartikel, die um mRNA-Moleküle angeordnet sind, die für die Spike-Sequenz von SARS-CoV-2 in voller Länge kodieren ( 20). Die transfizierte mRNA kann direkt translatiert werden, um das Spike-Protein herzustellen. Die BioNTech/Pfizer- und Moderna-mRNA-Impfstoffe, die von Regierungsbehörden weitgehend zugelassen und in mehreren Ländern verabreicht wurden, haben nach 1 bzw. 2 Dosen eine Wirksamkeit von etwa 50-70 bzw. 70-90 % gegenüber dem Wildtyp und Alpha gemeldet Variante (B.1.1.7) und 30-60 bzw. 60-90 % Wirksamkeit gegenüber den Beta- (B.1.351) und Gamma- (P.1) Varianten ( 21 , 22 ). Es wurde jedoch festgestellt, dass weitere besorgniserregende Varianten entweder eine weitere teilweise oder vollständige Immunflucht bieten; daher kann im Laufe der Zeit eine Anpassung der Sequenzen erforderlich sein ( 23 , 24). Vor COVID-19 waren keine DNA/RNA-Impfstoffe für die Anwendung beim Menschen zugelassen, aber im August 2021 erhielten BioNTech und Pfizer die FDA-Zulassung für die Verwendung ihres mRNA-Impfstoffs ( 25 ). Weitere Untersuchungen zu nukleinsäurebasierten Impfstoffverabreichungsplattformen könnten die Wirksamkeit verbessern.

Obwohl SARS-CoV-2-DNA/RNA-Impfstoffe vor der Massenverbreitung Gesundheits- und Sicherheitstests unterzogen wurden, wurde nach der Impfung eine Vielzahl von sowohl systemischen als auch lokalen (in der Nähe der Injektionsstelle) Nebenwirkungen beschrieben, die von leicht bis schwer reichen ( 26 , 27 ). Symptome, die denen einer Virusinfektion ähneln (z. B. Kopfschmerzen und Myalgie), lebensbedrohliche Zustände (z. B. Myokardverletzung und Thrombose) und Todesfälle wurden im Zusammenhang mit der Impfung berichtet ( 28 – 31). Obwohl einige Nebenwirkungen von den Verabreichungsmodalitäten herrühren können, haben mehrere Studien darauf hingewiesen, dass das Spike - Protein allein nachteilige Auswirkungen auf das Wirtsgewebe hat, wie z . Obwohl es schwierig ist, den Ursprung von Nebenwirkungen bei geimpften Personen festzustellen, sind weitere Untersuchungen zu den zellulären Wirkungen von mRNA-Impfstoffen oder dem exprimierten Proteinantigen gerechtfertigt, um sicherere Impfstoffe zu entwickeln.

Überlappende ORFs auf der Nukleotidsequenz des SARS-CoV-2-Spike-Proteins

Das Verständnis, dass eine mRNA für ein Gen in Eukaryoten kodiert, ohne Berücksichtigung alternativen Spleißens, wurde in Frage gestellt, nachdem mehrere Studien das Vorhandensein und die Translation mehrerer offener Leserahmen (ORFs) innerhalb einer exprimierten mRNA gezeigt haben ( 36 , 37 ). Außerdem wurde entdeckt, dass RNA-Abschnitte, die als nicht-codierend annotiert wurden, für kleine Peptide aus internen ORFs im größeren Gen codieren, die regulatorische Aktivität in der Zelle haben ( 38 , 39 ). Alternative Startcodons, interne Ribosomeneintrittsstellen und Frameshifting wurden alle als Mechanismen beschrieben, die zur Translation kleinerer ORFs innerhalb eines größeren exprimierten Gens beitragen ( 40 – 42). Darüber hinaus sind überlappende Gene ein gemeinsames Merkmal unter viralen Genomen ( 43 ). Überlappende Gene in Viren stammen von Mutationen, die die spontane Erzeugung einer Translationsstartstelle innerhalb eines Gens ermöglichen, die oft zu einem neuen ORF führt, normalerweise mit einem anderen Rahmen, während die Integrität des ursprünglichen Gens erhalten bleibt ( 44 ). Daher kann das Verständnis der Kodierungskapazität eines viralen Transkripts in einer menschlichen Zelle komplexer sein als die Bewertung der Proteinsequenz in voller Länge allein.

Es wurde festgestellt, dass mehrere ORFs zuvor annotierte Gene im SARS-CoV-2-Proteom überlappen ( 45 ). Beispielsweise wurde kürzlich unter Verwendung von Ribo-Seq- und phylogenetischen Analysen entdeckt, dass ORF3d und ORF9c die ORF3a- bzw. N-Gene überlappen ( 8 , 9 ). Zu den neu entdeckten überlappenden ORFs im SARS-CoV-2-Genom gehören ORF2b und ORF-Sh, von denen gezeigt wurde, dass sie die Spike-Proteinsequenz auf dem +1-Frame überlappen (ein Nukleotid in Richtung des 3'-Endes) ( 9 , 46 , 47). Die ORF2b- und ORF-Sh-Nukleotidsequenzen sind beide 120 Nukleotide lang und beide kodieren für 39 Aminosäuren lange Proteine. Es wurde festgestellt, dass ORF2b während der Infektion in menschlichen Zellen translatiert wird, und ORF-Sh wurde bisher nur durch eingehende phylogenetische Vergleiche gefunden. In einer genomischen Vergleichsstudie wurde festgestellt, dass ORF2b in fast allen Fledermaus-Coronavirus-Stämmen fehlt, was darauf hindeutet, dass es sich kürzlich entwickelt hat ( 48 ). ORF-Sh soll sich kürzlich unter der Gruppe von Viren entwickelt haben, zu denen die Coronavirus-Stämme Bat-CoV-RaTG13 und Pangolin gehören. In nur wenigen sequenzierten SARS-CoV-2-Stämmen wurden Mutationen entdeckt, die zu einer Verkürzung der Proteinsequenz führen ( 47 , 49). Über die Struktur oder Funktion dieser Proteine ​​ist wenig bekannt, obwohl vorhergesagt wird, dass beide eine Transmembrandomäne enthalten. Das Vorhandensein zusätzlicher offener Leserahmen innerhalb der Sequenz der Spike-Proteinsequenz wirft jedoch die Frage auf, ob diese oder andere überlappende ORFs auf DNA/RNA-Vakzinsequenzen translatiert werden. Da gezeigt wurde, dass die Translation überlappender akzessorischer ORFs die Dynamik von Wirtsprotein-Protein-Interaktionsnetzwerken signifikant verändert, kann die Translation dieser beiden und möglicherweise anderer ORFs innerhalb der Sequenz der Spike-Protein-RNA/DNA-Impfstoffe zu Signalstörungen führen die einer SARS-CoV-2-Infektion ähneln ( 50 , 51 ).

Da über die Funktionalität von ORF2b oder ORF-Sh in infizierten Zellen wenig berichtet wurde (obwohl die Übersetzung von ORF-Sh noch bestätigt werden muss) und keine homologen Domänen mit Sequenzanalysewerkzeugen gefunden wurden, verwendeten wir wie zuvor durchgeführte Methoden der strukturellen Bioinformatik um die dreidimensionalen Merkmale des SARS-CoV-2-Proteoms aufzuklären, um die strukturellen Eigenschaften beider ORFs zu modellieren ( 52 – 61 ). Wie in Abbildung 1A gezeigt , wird vorhergesagt, dass der Großteil des ORF2b-Proteins in der Membran fixiert ist ( 62)⁠. Vergleiche der strukturellen Ähnlichkeit ergaben, dass die vorhergesagte ORF2b-Transmembrandomäne der P-Oligomerisierungsdomäne des humanen Metapneumovirus-Phosphoproteins (HMPV) ähnelt (PDB: 5oix; TM-Score: 0,67), was zu Tetramerisierung oder anderen Oligomerisierungszuständen führen kann ( 1A ) ( 63 ) . Eine solche Oligomerisierung in der Membran könnte zu einer Viroporin-Aktivität führen – ähnlich wie bei den ORF3a- und E-SARS-CoV-2-Proteinen ( 64 , 65 ). Obwohl eine Transmembrandomäne in der ORF-Sh-Sequenz vorhergesagt wurde, zeigen Strukturmodellierung und Sekundärstrukturvorhersage eine Biegung in der Mitte der mutmaßlichen Transmembrandomäne ( Abbildung 1B). Strukturvergleiche ergaben eine Ähnlichkeit zwischen dem vorhergesagten ORF-Sh-Modell und DNA-bindenden Zinkfingerproteinen wie dem Transkriptionsrepressor CTCF (PDB: 1x6h; TM-Score: 0,38), was durch das Vorhandensein von vier basischen Aminosäuren weiter gestützt wird auf der vorhergesagten DNA-exponierten Seite, die in 1B ( 66 ) gezeigt ist. Eine experimentelle Validierung ist jedoch erforderlich, um diese Ergebnisse zu verifizieren. Nichtsdestotrotz kann die Translation von überlappenden, kleinen ORFs innerhalb größerer ORFs zu schädlichen Auswirkungen auf Wirtsgewebe führen, wie z. Daher sollte das proteinkodierende Potenzial von DNA/RNA-Vakzinen im Zusammenhang mit überlappenden ORFs weiter untersucht werden.

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Abbildung 1 Strukturelle Charakterisierung von ORF2b und ORF-Sh. Vollständiger ORF2b (cyan), ausgerichtet mit einem Protomer der HMPV P-Oligomerisierungsdomäne (grün), fixiert in einer Doppelschichtmembran (grau), ist dargestellt (A) . ORF-Sh (cyan) ausgerichtet auf das frühe Wachstumsreaktionsprotein 1 der Maus (EGR1) (PDB: 1p47) (grün), das ein Homolog des transkriptionellen Repressors CTCF ist, gebunden an DNA (grau) ist gezeigt (B) . Basische Reste im ORF-Sh-Protein sind als dunkelblaue Stäbchen (B) gezeigt .
Codon-Optimierung von DNA/RNA-Impfstoffkandidaten

Obwohl das Vorhandensein überlappender Gene auf der Wildtyp-Nukleotidsequenz des Spike-Proteins die Wirksamkeit von DNA/RNA-Impfstoffen in Frage stellt, können Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um die Translation dieser kleineren, internen ORFs zu verhindern. Beispielsweise können Impfstoff-Nukleotidsequenzen selektiv Codon-optimiert werden, wie es normalerweise durchgeführt wird, um die Translationseffizienz in Wirtsgeweben zu verbessern, um alternative Startcodons und interne Ribosomen-Eintrittsstellen zu entfernen, wodurch eine unspezifische Erkennung durch ribosomale Komplexe verhindert wird ( 67). Eine Codon-Optimierung ohne Berücksichtigung überlappender ORFs kann jedoch sowohl zu einer Unterbrechung der aktuellen überlappenden ORFs, ORF2b und ORF-Sh im Fall der Spike-Protein-Impfstoffe, als auch zur spontanen Erzeugung neuer ORFs führen. Obwohl berichtet wurde, dass die meisten, wenn nicht alle Spike-Sequenzen von DNA/RNA-Impfstoffkandidaten für die Translation in menschlichen Zellen codonoptimiert sind, wurden die Spike-Nukleotidsequenzen bisher von den entsprechenden Unternehmen oder Institutionen weitgehend privat gehalten. Interessanterweise wurden jedoch die Moderna-mRNA-1273- und Pfizer-BNT162b2-Impfstoff-mRNA-Sequenzen öffentlich zugänglich gemacht ( https://github.com/NAalytics ; https://berthub.eu/articles/posts/reverse-engineering-source- code-of-the-biontech-pfizer-impfstoff/). Die Veröffentlichung dieser Daten ermöglicht direkte Vergleichsanalysen zwischen den mit dem Impfstoff formulierten und den Wildtyp-Spike-Proteinsequenzen.

Der Vergleich der Nukleotidsequenzen der Wildtyp- und Impfstoff-mRNA-Spike-Proteine ​​kann das Ausmaß aufzeigen, in dem die Sequenzen während der Codon-Optimierung geändert wurden, wodurch möglicherweise die Translationseffizienz des Spike-Proteins und überlappende ORFs verändert werden. Bemerkenswerterweise haben beide Unternehmen vor der Codon-Optimierung berichtet, Prolin-Mutationen zur Stabilisierung und Erhaltung der Spike-Proteinstruktur einzubeziehen, was auch kleine Änderungen des Spike-Aminosäuregehalts impliziert. Unter Verwendung des EMBOSS Needle Pairwise Sequence Alignment Tools wurde festgestellt, dass die Wildtyp-Spike-Sequenz (NCBI-Zugang: NC_045512) zu 68,7 % und 45,3 % mit den mRNA-1273- und BNT162b2-Impfstoff-Spike-Sequenzen identisch ist (im Gegensatz zur Gesamtheit der mRNA -Sequenz), und die Spike-Sequenzen von mRNA-1273 und BNT162b2 sind zu 48,6 % identisch (68 ). Die GC-Gehalte der Wildtyp-, BNT162b2- und mRNA-1273-Spike-Nukleotidsequenz, die gut mit der Translationseffizienz korrelieren, betragen 37,3 %, 56,9 % bzw. 62,3 %. Diese Ausrichtungen zeigen, dass während der Impfstoffherstellung eine umfangreiche Codon-Optimierung durchgeführt wurde.

Um den Grad zu quantifizieren, in dem die an den mRNA-Sequenzen des Impfstoffs durchgeführte Codon-Optimierung mit dem Aminosäurepool des menschlichen Genoms übereinstimmt, wurde für alle der Codon-Anpassbarkeitsindex (CAI) berechnet, der als genauer Indikator für die Gentranslation gilt drei Spike-Sequenzen unter Verwendung der Cousin- und CAIcal-Webserver ( 69 – 71 ). Als Referenz liegen die berechneten CAI-Werte für SARS-CoV-2-Gene in Bezug auf die menschliche Codon-Nutzung im Durchschnitt bei etwa 0,7, und eine höhere Punktzahl stellt einen stärkeren Hinweis auf eine Translation dar ( 72 , 73). Die CAI-Werte für die Wildtyp-, BNT162b2- und mRNA-1273-Spike-Nukleotidsequenzen betragen 0,703, 0,715 bzw. 0,981. Während der CAI-Wert des BNT162b2-Impfstoffs im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz leicht erhöht war, war der CAI-Wert des mRNA-1273-Impfstoffs signifikant höher und erreichte fast den Maximalwert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die bei beiden Impfstoffsequenzen verwendete Codon-Optimierung zu einem höheren Translationspotential als beim Wildtyp geführt hat. Bemerkenswerterweise scheint die mRNA-1273-Impfstoff-Codon-Verwendung viel enger mit menschlichen Codon-Verzerrungen übereinzustimmen, und die Sequenz enthält eine geringere Menge an substituierten Nukleotiden und einen höheren GC-Gehalt.
Überlappende ORFs auf DNA/RNA-Impfstoffkandidaten

In Anbetracht der umfangreichen Codon-Optimierung, die an den Impfstoff-Spike-Sequenzen durchgeführt wurde, kann der Vergleich mutmaßlicher ORFs in den Wildtyp- und ausgewählten Impfstoff-mRNA-Sequenzen Aufschluss über das proteinkodierende Potenzial von DNA/RNA-Sequenzen geben, die in SARS-CoV-2-Impfstoffen verwendet werden. Um die Unterschiede zwischen den verfügbaren ORFs auf den Wildtyp-, Moderna-mRNA-1273- und Pfizer-BNT162b2-Sequenzen zu untersuchen, wurden mutmaßliche ORFs aller drei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des NCBI-ORFfinder-Webservers ( https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/). Obwohl die ORF-Identifizierung mit diesem Tool keine Translation impliziert, kann ein Überblick über die verfügbaren Leseraster Einblicke in mögliche Codierungsunterschiede zwischen den Wildtyp- und Impfstoffkandidatensequenzen geben. Die minimale ORF-Länge wurde auf die standardmäßigen 75 Nukleotide eingestellt, es wurden keine alternativen Initiationscodons zugelassen und nur „ATG“-Startstellen wurden berücksichtigt.

Wie in Abbildung 2 gezeigt, ORF2b und ORF-Sh wurden in der Wildtyp-Sequenz gefunden; jedoch fehlen beide ORFs in beiden mRNA-Vakzinkandidatensequenzen. Es wurde festgestellt, dass sich die Anzahl, Länge und Sequenzidentität der vorhergesagten ORFs auf beiden mRNA-Sequenzen deutlich voneinander und vom Wildtyp unterscheiden, was erneut bestätigt, dass die Codon-Optimierung zu signifikanten Änderungen in Gegenwart überlappender ORFs führen kann. Elf kleine überlappende ORFs (27–87 Reste lang) wurden unter Verwendung von NCBI ORFfinder auf der Wildtyp-Spike-Proteinsequenz entdeckt, und es wurde festgestellt, dass acht kleine ORFs (26–52 Reste lang) die Pfizer BNT162b2-Impfstoff-mRNA-Sequenz überlappen. Bemerkenswerterweise zeigte die Moderna-mRNA-1273-Impfstoff-mRNA-Sequenz keine überlappenden Sequenzen auf dem positiven Sense-Strang – nur auf dem negativen Sense-Strang, der bei der Betrachtung von mRNA vernachlässigt werden kann. Aber,73). Daher scheint der Moderna-mRNA-1273-mRNA-Impfstoff in Bezug auf das vorhergesagte Proteincodierungspotenzial die am besten optimierte Sequenz der beiden zu sein, um ausschließlich für das SARS-CoV-2-Spike-Protein zu codieren. Diese Ergebnisse unterstützen auch die Vorstellung, dass Codons von Impfstoffkandidatensequenzen zuverlässig editiert werden können, um unerwünschte ORFs zu entfernen. Neu vorhergesagte ORFs auf der Pfizer-BNT162b2-Impfstoff-mRNA-Sequenz unterstreichen andererseits die Tatsache, dass die Codon-Optimierung auch zur spontanen Erzeugung neuer überlappender ORFs führen kann. Von Interesse ist die Beobachtung, dass das Ermöglichen des Nachweises alternativer Initiationscodons die Anzahl der vorhergesagten ORFs auf dem positiven Sense-Strang des Wildtyps (11 bis 19 ORFs), BNT162b2 (8 bis 25) und mRNA-1273 (0 bis 4 ) Sequenzen. Experimentelle Validierung und eingehende genomische Analyse und Anmerkungen, jedoch

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Abbildung 2 ORFs, die auf den Wildtyp-, BNT162b2- und mRNA-1273-Spike-Sequenzen nachgewiesen wurden. Die ORFs, die mit NCBI ORFfinder für die ORFs identifiziert wurden, die auf den Spike-Sequenzen vom Wildtyp (oben), BNT162b2 (Mitte) und mRNA-1273 (oben) nachgewiesen wurden, sind dargestellt. Das Vorhandensein von ORF2b und ORF-Sh (ORF3 bzw. ORF10 in der NCBI-ORFfinder-Ausgabe) ist auf der Wildtyp-Sequenz (oben) vermerkt.

Zusätzliche Schritte zum Ausschließen überlappender ORFs auf DNA/RNA-Impfstoffsequenzen

Alternativ zur Codon-Optimierung besteht eine weitere Option zum Schutz vor überlappenden ORFs in einem Impfstoffkandidaten darin, kurze Abschnitte der Proteinsequenz(en) auszuwählen, die für die antigenesten Regionen kodieren, wie durch den mRNA-Impfstoff Pfizer BNT162b1 veranschaulicht, der für ein trimeres Konstrukt kodiert der rezeptorbindenden Domäne des SARS-CoV-2-Spike-Proteins ( 74). Eine kürzere Sequenz kann ein geringeres Potenzial haben, für andere kleinere Proteine ​​zu kodieren. ORF-Vorhersagen unter Verwendung des NCBI ORFfinder an den Nukleotidsequenzen, die der Rezeptorbindungsdomäne (Nukleotide 999–1569 auf der Wildtyp-Spike-Sequenz) der Wildtyp-, BNT162b2- und mRNA-1273-Spike-Proteine ​​entsprechen, ergaben das Vorhandensein von drei (29 –36 aa), zwei (28 und 44 aa) bzw. null ORFs auf alternativen Frames und drei (29–69 aa), sechs (27–53 aa) bzw. ein (170 aa) ORFs, wenn unter Berücksichtigung alternativer Initiationscodons. Obwohl die Verkürzung der Spike-Sequenz die Anzahl der überlappenden ORFs reduziert, bleibt das Potenzial für eine alternative Translation bestehen.

Multimere Impfstoff-DNA/RNA-Sequenzen, die antigene Regionen verschiedener viraler Proteine ​​enthalten, könnten auch verwendet werden, um die Immunogenität zu erhöhen, während die Länge des Konstrukts verkürzt und somit das Vorhandensein überlappender ORFs kontrolliert wird ( 75 – 77 ). Beispielsweise wurde das Hepatitis-C-E2-Proteingerüst verwendet, um die antigene HIV-1-gp120-Variable-Loop-Region zu präsentieren, um die Immunogenität für eine potenzielle HIV-Impfung zu fördern ( 78 ). Somit kann die Verkleinerung der Sequenz, um nur die antigenischsten Regionen der Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne, wie das Rezeptor-Bindungsmotiv, oder Domänen von anderen viralen Proteinen, die auf einem Codon-optimierten Proteingerüst platziert werden sollen, einzuschließen, weiter kontrollieren überlappende proteinkodierende Sequenzen ( 79). Sequenzlänge und -inhalt können die Anzahl der überlappenden ORFs weiter beeinflussen, aber die Untersuchung proteinkodierender Regionen beruht dennoch auf der Validierung der Translation alternativer Leserahmen.

Die Verwendung von experimentellen Techniken, wie z. B. ribosomales Profiling oder Massenspektrometrie, an geimpften Patienten- oder Labortierproben oder Pseudovirus-infizierten Gewebekulturen kann dabei helfen, festzustellen, ob die überlappenden ORFs translatiert werden und in welchem ​​Ausmaß sie im Vergleich zum beabsichtigten Protein translatiert werden. Daher können mehrere potenzielle Kontrollpunkte verwendet werden, um die Translation kleiner ORFs innerhalb von DNA/RNA-Impfstoffkandidatensequenzen zu kontrollieren. Andernfalls könnten unbeabsichtigte Proteine ​​von der Wirtszelle translatiert werden, was zu Nebenwirkungen führen kann, die denen einer Virusinfektion ähneln.

Schlussfolgerungen

DNA/RNA-Impfstoffe haben sich als wirksame Methode zur schnellen Entwicklung von Impfstoffen gegen neu auftretende Krankheitserreger erwiesen. Mit einer neuen Reihe von Lösungen kommt jedoch eine neue Reihe von Problemen ( 80). Obwohl festgestellt wurde, dass die Nukleotidsequenz des Wildtyp-SARS-CoV-2-Spike-Proteins für translatierte überlappende Gene kodiert, zeigen ORF-Erkennungsvorhersagen für die Sequenzen von zwei mRNA-Impfstoffen, dass die Codon-Optimierung das Potenzial hat, die unspezifische Translation zu stören. Zusätzliche überlappende ORFs können während der Codon-Optimierung entstehen; daher sollten die endgültigen Sequenzen dennoch auf ihr proteinkodierendes Potenzial untersucht werden. Bei DNA-Vakzinen und viralen Vektoren sollte auch der Negativ-Sense-Strang auf sein proteinkodierendes Potential überprüft werden. Darüber hinaus sollte die spontane Generierung von ORFs neu bewertet werden, wenn besorgniserregende Varianten bekannt werden und Impfstoffe geändert werden, um sie aufzunehmen. Es wurden viele Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um die Sicherheit und Wirksamkeit der mRNA-Impfstoffe zu gewährleisten.20 ). Daher kann die Einbeziehung zusätzlicher Schritte, um sicherzustellen, dass Impfstoffsequenzen ausschließlich für das beabsichtigte Protein codieren, auch zu besseren Gesundheits- und Sicherheitsergebnissen führen. Maßnahmen zur Überprüfung auf andere nachteilige Auswirkungen auf Wirtszellen, wie z. B. solche, die sich aus potenziellen Wechselwirkungen von Impfstoff-Nukleotidsequenzen mit Wirts-RNAs oder -Proteinen oder dem Wirtsmikrobiom ergeben, können ebenfalls die Wirksamkeit und Sicherheit erhöhen ( 81 )⁠. Eine eingehendere Untersuchung dieser Verabreichungsmethoden kann Aspekte aufdecken, die weiter verfeinert werden sollten, um sich vor unbeabsichtigten Nebenwirkungen zu schützen.

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Grüße

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Ich bin und zugleich nicht.