zu Bromelain

reefan, Ungarn, Sonntag, 17.10.2021, 21:00 (vor 894 Tagen) @ Olivia1724 Views

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Bromelain hemmt SARS-CoV-2-Infektion in VeroE6-Zellen

Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das schwere akute respiratorische
Syndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) verursacht. Die anfängliche Interaktion zwischen dem
SARS-CoV-2 Spike (S)-Protein, das durch die Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2) aktiviert
wird, und dem Wirtszellrezeptor Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE-2) ist ein wichtiger
Schritt für die Pathogenese dieses neuartigen Coronavirus. Hier haben wir eine GFP-markierte
SARS-CoV-2 S-Ectodomäne in Tni-Insektenzellen exprimiert. Diese enthielt mit Sialinsäure
angereicherte N- und O-Glykane. Oberflächenresonanzplasmonen (SPR) und Luminex-Tests
zeigten, dass die gereinigte S-Ectodomain an menschliches ACE-2 bindet und Immunreaktivität
mit COVID-19-positiven Proben aufweist. Wir zeigen, dass die Behandlung mit Bromelain (isoliert
aus dem Ananasstamm und als Nahrungsergänzungsmittel verwendet) die Expression von ACE-2
und TMPRSS2 in VeroE6-Zellen vermindert und die Expression von S-Ectodomain drastisch senkt.
Besonders wichtig ist, dass die Behandlung mit Bromelain die Interaktion zwischen SEctodomain und VeroE6-Zellen verringerte. Vor allem aber verringerte die Behandlung mit
Bromelain die SARS-CoV-2-Infektion in VeroE6-Zellen erheblich. Insgesamt deuten unsere
Ergebnisse darauf hin, dass Bromelain oder bromelainreicher Ananasstamm als antivirales Mittel
gegen COVID-19 eingesetzt werden kann.
Einführung
Das neue Coronavirus, das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2),
überträgt sich schnell von Mensch zu Mensch und führt zu einer anhaltenden Pandemie. Ältere
Erwachsene und Menschen mit Vorerkrankungen wie Herz- und Lungenkrankheiten, Diabetes
und Krebs haben ein erhöhtes Risiko, an schweren Komplikationen einer COVID-19-Erkrankung
zu erkranken und sogar zu sterben. Bis zum 14. September 2020 haben sich weltweit mehr als
28 918 900 Menschen infiziert, mit 922 252 Todesfällen, davon 6 426 958 Menschen in den USA
mit 192 612 Todesfällen (1). SARS-CoV-2 infiziert ACE-2-exprimierendes Lungen-, Nieren- und
Hodengewebe von Patienten, was zu Organversagen und manchmal zum Tod führen kann (2, 3).
Das homotrimere virale Spike-Protein (S1) von SARS-CoV-2 bindet an den ACE-2-Rezeptor der
Wirtszelle, um in diese einzudringen, gefolgt von der S2-vermittelten Membranfusion (4, 5). Das
S-Protein wird durch TMPRSS2, das auf der Oberfläche der Wirtszelle exprimiert wird,
proteolytisch aufbereitet (6). TMPRSS2 ist ein 70 kDa Typ II Transmembranglykoprotein mit
Serinproteaseaktivität, das in vielen Geweben exprimiert wird (7). TMPRSS2 weist neun
stabilisierende Disulfidbindungen und zwei N-Glykanstellen auf (UniProtKB - O15393). Die
Priming-Aktivität von TMPRSS2 ist für viele Virusinfektionen, darunter das Influenza-A-Virus (8, 9),
SARS-CoV (10) und SARS-CoV-2 (6), unerlässlich. Das SARS-CoV-2 Spike (S)-Protein ist ein stark
glykosyliertes Transmembranglykoprotein mit 1273 Aminosäuren. Es verfügt über mehrere
funktionelle Domänen, darunter die N-terminale Domäne (NTD), die rezeptorbindende Domäne
(RBD), das Fusionspeptid (FP), die Heptad-Repeat-Domäne 1 (HR1), die zentrale Helix (CH), die
Konnektor-Domäne (CD), die Transmembrandomäne (TM) und ein zytoplasmatischer Schwanz
(CT) (11). Kürzlich haben Studien gezeigt, dass das Spike-Protein von SARS-CoV-2 22 Ngebundene und 2 O-gebundene Glykanstellen aufweist. Die meisten dieser N-Glykane bestehen
aus Oligomannose, Hybrid- und Komplexglykanen, und die O-Glykane sind von Core-1-Strukturen
abgeleitet, die möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Proteinfaltung, Rezeptorbindung und
Immunabwehr spielen (12-14).
Derzeit werden COVID-19-Patienten mit verschiedenen Virostatika (Favilavir und Remdesivir)
(15-17), Malariamitteln (Chloroquin und Hydroxychloroquin) (18), viralen Proteasehemmern
(Lopinavir und Darunavir) (18, 19) und Entzündungshemmern (Tocilizumab) (20) behandelt. Die
Ansprechrate ist jedoch bescheiden, und die Sicherheit und Wirksamkeit dieser Medikamente
gegen COVID-19 muss noch durch klinische Studien bestätigt werden. Daher besteht ein
dringender Bedarf an der Umwidmung bestehender Medikamente oder der Entwicklung neuer
virus- und wirtsbasierter Virostatika gegen SARS-CoV-2. Hier haben wir die Wirkung von
Bromelain auf den Wirtszellrezeptor ACE-2, TMPRSS2 und die S-Ectodomain von SARS-CoV-2
untersucht. Bromelain wird aus dem Ananasstamm isoliert, ist eine Cysteinprotease und wirdals Nahrungsergänzungsmittel zur Behandlung von Patienten mit Schmerzen und Entzündungen
(21) und Thrombose (22) eingesetzt. Hier zeigen wir, dass Bromelain die SARS-CoV-2-Infektion in
VeroE6-Zellen hemmt, indem es die Expression von ACE-2, TMPRSS2 und SARS-CoV-2-S-Protein
verändert.
Ergebnisse und Diskussion
Bromelain hemmt die Expression von ACE-2 und TMPRSS2
Kürzlich haben Studien gezeigt, dass das SARS-CoV-2 S-Protein menschliches ACE-2 als Rezeptor
für den viralen Eintritt nutzt (4, 5). Daher untersuchten wir die Expression von ACE-2 und
TMPRSS2 in verschiedenen normalen und kanzerösen Zellen. Von den getesteten normalen und
kanzerösen Zellen wiesen VeroE6- und Calu-3-Zellen eine ACE-2-Proteinexpression (Abbildung 1A)
sowie einen Basalwert des TMPRSS2-Proteins (Abbildung 1B) auf. Es wurde nachgewiesen, dass
menschliches ACE-2 ein Typ-I-Transmembranglykoprotein ist, das aus 805 Aminosäuren besteht.
Es besitzt eine extrazelluläre N-terminale Domäne, die eine Zinkmetallopeptidase-Domäne (HEXHMotiv) und eine C-terminale Domäne enthält (23, 24). ACE-2 verfügt über 7 potenzielle NGlykosylierungs- und 3 O-Glykosylierungsstellen, die bei der Proteinfaltung und Virusbindung
eine wichtige Rolle spielen können (13). Die Zink-Metallopeptidase-Domäne ist für die Bindung
an das virale Spike-Protein verantwortlich. Die extrazelluläre Domäne von ACE-2 hat sechs
Cysteinreste mit drei stabilisierenden Disulfidbindungen (25). Darüber hinaus wird für TMPRSS2
vorhergesagt, dass seine extrazelluläre Domäne 18 Cysteinreste mit neun stabilisierenden
Disulfidbindungen aufweist (UniProtKB - O15393). Da ACE-2 und TMPRSS2 mit Cysteinresten
angereichert sind, die Disulfidbindungen zur Stabilisierung der Proteinstruktur bilden, haben wir
die Wirkung von Bromelain (Cysteinprotease) auf die Expression von ACE-2 und TMPRSS2
untersucht. Bromelain reduziert die Expression von ACE-2 und TMPRSS2 in VeroE6-Zellen
dosisabhängig (19, 37 und 75 μg/ml / 48 h) (Abbildung 1C). Da es 48 Stunden dauerte, bis
Bromelain die Expression von ACE-2 in vollständigen Medien reduzierte, untersuchten wir, ob
die hemmende Wirkung von Bromelain eine direkte oder indirekte Wirkung auf diese beiden
Proteine ist. Zu diesem Zweck behandelten wir VeroE6-Zellen mit Bromelain (75 ug/ml) über
einen kürzeren Zeitraum (0-4 h) unter serumfreien Bedingungen. Interessanterweise reduzierte
Bromelain die Expression von ACE-2 und TMPRSS2 zu einem frühen Zeitpunkt (2 h) (Abbildung
1D). Allerdings war die cysteinproteolytische Aktivität von Bromelain bei ACE-2 höher als bei
TMPRSS2. Anschließend bestätigten wir die Aktivität von Bromelain durch die Behandlung von
rekombinantem TMPRSS2 (Abnova, CA, USA), das einen vollständigen Verlust von TMPRSS2
zeigte (Abbildung 1E). Wir bestätigten diese Ergebnisse durch Inkubation von VeroE6-Zellen mit
dem Cysteinproteaseinhibitor E-64 (4 μM) zusammen mit Bromelain (75 μg/ml) und zeigten eine
intakte ACE-2- und TMPRSS2-Proteinexpression im Vergleich zu Bromelain allein (Abbildung 1F).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Cysteinprotease-Aktivität von Bromelain die
Expression von ACE-2 und TMPRSS2 in VeroE6-Zellen reduziert. Da VeroE6-Zellen ACE-2 und
TMPRSS2 in basalen Mengen exprimieren und SARS-CoV-2 VeroE6-Zellen infizieren kann (26, 27),
haben wir diese Zelllinie für den Rest der Studien verwendet.
Bromelain spaltet SARS-CoV-2 Spike-Protein
Studien haben gezeigt, dass das SARS-CoV-2-Spike-Protein im Vergleich zum SARS-CoV-1-SpikeProtein eine 10- bis 20-fach höhere Bindungsaffinität mit ACE-2 für die virale Pathogenese
aufweist (28). Daher klonierten und exprimierten wir die Ektodomäne des SARS-CoV-2-SpikeProteins, die Insektenzell-Sekretionssignal- (SP), NTD-, RBD-, FP-, HR1-, CH- und CD-Domänen
(1-1220 Aminosäuren) zusammen mit C-terminalem GFP und 12-fachem His-Tag sowie einer
mutierten Furin-Spaltstelle enthält (Abbildung 2A und Abbildung S1). Das berechnete
Molekulargewicht des gereinigten S-Ectodomain-GFP-Proteins beträgt ~165 kDa; wir
beobachteten jedoch ein höheres Molekulargewicht der S-Ectodomain (~215 kDa), was auf eine
starke N- und O-gebundene Glykosylierung zurückzuführen sein könnte (Abbildung 2B). Als
nächstes wurde die Interaktion zwischen der gereinigten S-Ectodomain und humanemrekombinantem ACE-2 mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Technologie
untersucht. Die SPR-Analyse ergab, dass die S-Ectodomain an den Rezeptor ACE-2 bindet.
Außerdem nahm die Bindung konzentrationsabhängig zu und hatte eine vergleichbare
Bindungsaffinität wie die RBD-Kontrollbindung an ACE-2 (Abbildung 2B). Wir überprüften auch, ob
die exprimierte S-Ectodomain von Antikörpern aus COVID-19-Patientenproben erkannt werden
kann; dazu führten wir einen serologischen Luminex-Test mit de-identifizierten COVID-19-
positiven (n=6) und COVID-19-negativen (n=6) UNMC-Patientenproben durch. Die Ergebnisse des
Luminex-Tests zeigten eine signifikant erhöhte mediane Fluoreszenzintensität (MFI) der SEctodomain bei COVID-19-positiven Patientenproben (P<0,0001) (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse
zeigen, dass die gereinigte S-Ectodomain korrekt gefaltet und aktiv ist. Da die S-Ectodomain 22
N-Glykosylierungs- und 2 O-Glykosylierungsstellen (12-15) aufweist, untersuchten wir die Art der
Glykosylierung auf der gereinigten S-Ectodomain. Abbildung 2D zeigt die schematische
Darstellung der N- und O-verknüpften Glykosylierungsstellen im S-Protein (12, 13). Die
Behandlung der S-Ectodomain mit N-Glykanase (PNGase F) führte zu einer erhöhten
Mobilitätsverschiebung und Destabilisierung des Proteins, was auf den Verlust schwerer NGlykane zurückzuführen sein könnte (Abbildung 2E). Die Behandlung von S-Ectodomain mit OGlykanase (spezifisch für Core 1 O-Glykan) zeigte jedoch eine leicht verringerte
Proteinmobilitätsverschiebung, was die früheren Ergebnisse unterstützt, dass das S-Protein nur
zwei O-verknüpfte, von Core 1 abgeleitete Glykane in seinem RBD-Rückgrat hat (Abbildung 2E).
Umgekehrt führte die Behandlung der S-Ectodomain mit Sialidase A (die die Sialinsäuregruppe
entfernt) entweder allein oder in Kombination mit N-Glykanase oder O-Glykanase oder
zusammen zu einer merklichen Veränderung der Migration der S-Ectodomain. Diese geringere
Beweglichkeit der S-Ectodomain könnte auf den Verlust negativ geladener Sialinsäuregruppen in
den N- und O-verknüpften Glykanen zurückzuführen sein (Abbildung 2E). Diese Ergebnisse
zeigen, dass das SARS-CoV-2-Spike-Protein sowohl hoch sialylierte N- als auch O-gebundene
Glykane aufweist.
Die rezeptorbindende Domäne besteht aus fünf antiparallelen β-Folien (β1, β2, β3, β4 und β7)
mit kurzen Verbindungshelices und Schleifen, die den Kern bilden. Innerhalb dieser Kernstruktur
gibt es ein ausgedehntes insertionsartiges Motiv, das als rezeptorbindendes Motiv (RBM)
bezeichnet wird und mit Resten des Coronavirus in Kontakt steht, die an ACE-2 binden (29).
Das SARS-CoV-2-S-Protein hat 30 Cystein-Aminosäuren mit 15 stabilisierenden Disulfidbindungen
in der Ectodomäne (UniProtKB: P0DTC2) (Abbildung 2F). Die RBD-Domäne allein hat neun
Cysteinreste, von denen acht vier Disulfidbindungen bilden. Von diesen vier Paaren befinden
sich drei im Kern (Cys336-Cys361, Cys379-Cys432 und Cys391-Cys525), die zur Stabilisierung der
β-Sheet-Struktur beitragen. Das verbleibende Paar (Cys480-Cys488) verbindet die Schleifen am
distalen Ende der RBM (29). Da Bromelain eine Cysteinprotease-Aktivität hat, untersuchten wir
die Wirkung von Bromelain auf die S-Ectodomain-Expression. Die Inkubation des Überstands von
Tni-Insektenzellen, die S-Ectodomain enthalten, mit Bromelain zeigte eine dosisabhängige
Verringerung der Expression von S-Ectodomain (5, 10, 15, 20 und 25 μg/mg Gesamtprotein/
Stunde) (Abbildung 2G). Als nächstes untersuchten wir die durch Bromelain induzierte Spaltung
der S-Ectodomain in Abhängigkeit von der Zeit. Die Behandlung mit Bromelain (25 μg/mg
Gesamtprotein) spaltete die S-Ectodomain bereits nach 10 Minuten bei 37 °C vollständig ab
(Abbildung 2H). Eine niedrigere Bromelain-Konzentration (10 μg/mg Gesamtprotein) spaltete die
S-Ectodomain jedoch sogar bis zu 120 Minuten bei 37 °C teilweise ab (Daten nicht gezeigt). Als
nächstes bestätigten wir diese Ergebnisse durch Behandlung der gereinigten S-Ectodomain mit
Bromelain (1 μg/10 μg gereinigtes Protein), was eine vollständige Spaltung der S-Ectodomain in
einer zeitabhängigen Weise zeigte (Abbildung 2I). Um diese Ergebnisse weiter zu validieren,
haben wir hitzeinaktiviertes Bromelain auf Tni-Überstand verwendet, der im Vergleich zur
Behandlung mit Bromelain (25 μg/mg Gesamtprotein) eine intakte S-Ectodomain zeigte
(Abbildung 2J), Außerdem haben wir den Überstand von S-Ectodomain exprimierenden Tni-Zellen
mit E-64 (Cysteinproteaseinhibitor, 1, 2 und 4 μM) plus Bromelain (25 μg/mg Gesamtprotein) 30
Minuten lang inkubiert, was im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit Bromelain eine intakte
S-Ectodomain ergab (Abbildung 2K). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Bromelain wie ein
zweischneidiges Schwert wirken kann, indem es sowohl das vom Wirt stammende ACE-2,TMPRSS2 als auch die vom Virus stammende S-Ectodomain abbaut, und somit die SARS-CoV-2-
Infektion hemmen kann.
Bromelain hemmt die S-Ectodomain-Bindung und die SARS-CoV-2-Infektion
Da Bromelain ACE-2, TMPRSS2 und S-Ectodomain verdaut, untersuchten wir die Wirkung von
Bromelain auf die Interaktion zwischen S-Ectodomain und VeroE6-Zellen mittels
Immunfluoreszenz. Interessanterweise beobachteten wir eine reduzierte Bindung von SEctodomain in mit Bromelain (75 μg/ml für 1 h) behandelten VeroE6-Zellen im Vergleich zur
Vehikelkontrolle (Abbildung 3A). Wir bestätigten diese Ergebnisse auch durch
Durchflusszytometrie. Wir stellten eine verringerte Bindung von S-Ectodomain in mit Bromelain
vorbehandelten VeroE6-Zellen im Vergleich zur Vehikelkontrolle fest (Abbildung 3B,
Histogramm). Die mittlere Fluoreszenzintensität (GFP) der S-Ectodomain-Bindung war in den mit
Bromelain behandelten VeroE6-Zellen im Vergleich zum Vehikel deutlich reduziert (p<0,0001)
(Abbildung 3C). Um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen, inkubierten wir E-64
(Cysteinproteaseinhibitor) plus Bromelain und S-Ectodomain zusammen mit VeroE6-Zellen, was
zu einer verstärkten Bindung von S-Ectodomain an VeroE6-Zellen im Vergleich zu Bromelain
allein führte (Abb. 3D). Diese Ergebnisse zeigen, dass Bromelain wie ein zweischneidiges
Schwert wirken kann, indem es sowohl ACE-2 als auch S-Ectodomain spaltet und dadurch die SProteinbindung in VeroE6-Zellen hemmt. Da Bromelain die S-Ectodomain-Bindung an VeroE6-
Zellen hemmt, haben wir untersucht, ob Bromelain die SARS-CoV-2-Infektion in VeroE6-Zellen
hemmen kann. Zu diesem Zweck haben wir VeroE6-Zellen mit dem SARS-CoV-2-Virus (BEI_USAWA1/2020) mit einem Titer von 0,01 MOI infiziert, die mit dem Vehikel kontrolliert und mit
Bromelain vorbehandelt wurden. Die infizierten Zellen wurden fixiert und mit einem SARS-CoV-2
S-Protein-spezifischen Antikörper angefärbt, der eine Verringerung der Anzahl der infizierten
Zellen bei Bromelain-Behandlung zeigte (Abbildung 3E, repräsentatives Bild von n=6). Der
Prozentsatz der grün fluoreszierenden positiven Zellen wurde mit der Nikon D-Elements
Software quantifiziert. Wir beobachteten einen signifikant geringeren Prozentsatz an mit SARSCoV-2 infizierten VeroE6-Zellen bei der Behandlung mit Bromelain im Vergleich zum Vehikel
(p=0,0011) (Abbildung 3E). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Bromelain die
SARS-CoV-2-Infektion in VeroE6 wirksam hemmen kann.
Kürzlich haben Studien gezeigt, dass das S-Protein von SARS-CoV-2 eine hohe Homologie mit
anderen Coronaviren (76 % Identität mit SARS-CoV) (30) mit konservierten Cystein-Aminosäuren
aufweist (UniProtKB: P59594). Dies deutet darauf hin, dass Bromelain als breit gefächertes
antivirales Mittel gegen SARS-CoV2 und andere verwandte Familienmitglieder eingesetzt werden
kann.
Die derzeit verwendeten Medikamente gegen SARS-CoV-2 haben potenzielle Nebenwirkungen.
Impfstoffversuche gegen COVID-19 sind angelaufen, aber ein Impfstoff wird voraussichtlich nicht
vor Ende 2020 für den Einsatz beim Menschen zur Verfügung stehen. Außerdem ist die
Immunreaktion des Wirtes gegen SARS-CoV-2 nicht vollständig geklärt. Sie unterscheidet sich
von Person zu Person und auch bei einer erneuten Infektion von Personen mit SARS-CoV-2.
Derzeit laufen klinische Versuche mit COVID-19-Patienten, bei denen entweder ACE-2, TMPRSS2
oder das Spike-Protein als Zielmolekül eingesetzt werden. Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten
Mal, dass Bromelain eine SARS-CoV-2-Infektion hemmen kann, indem es auf alle drei
Wirtsproteine ACE-2 und TMPRSS2 sowie auf die S-Proteine von SARS-CoV-2 wirkt. Außerdem
haben Studien gezeigt, dass Bromelain zur Behandlung von Patienten mit Schmerzen und
Entzündungen eingesetzt werden kann, gut absorbiert wird und biologisch aktiv bleibt (21, 31).
Daher könnte entweder Bromelain oder bromelainreicher Ananasstamm als antivirales Mittel zur
Behandlung von COVID-19 und künftigen Ausbrüchen anderer Coronaviren eingesetzt werden.Materialien und Methoden
Zellen und Zellkulturbedingungen
Epithelzellen der afrikanischen grünen Affenniere (VeroE6, ATCC, VA, USA), humane
Lungenadenokarzinomzellen (A549, ein Geschenk von Maher Abdulla, Abteilung für Pathologie
und Mikrobiologie, UNMC, und Calu-3, ein Geschenk von John Dickinson, Abteilung für Innere
Medizin, Lungenheilkunde, Intensivmedizin und Schlafmedizin, UNMC), humane normale
bronchiale Epithelzellen (BEAS-2B, eine freundliche Spende von Todd Wyatt, Abteilung für Innere
Medizin, Lungenheilkunde, Intensivmedizin und Schlafmedizin, UNMC), menschliche
Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (T3M4, eine freundliche Spende von Michael A. Hollingsworth,
Eppley Institute for Research in Cancer, UNMC) und menschliche embryonale
Nierenepithelzellen (HEK293T, ATCC, VA, USA) wurden für diese Studie verwendet. VeroE6, A549,
T3M4 und HEK293T wurden in DMEM (Gibco, MA, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS,
Corning, MA, USA) und 1X Penicillin und Streptomycin (Corning, MA, USA) gezüchtet. BEAS-2BZellen wurden in DMEM mit 5% FBS und 1X Penicillin und Streptomycin gezüchtet. Alle Zellen
wurden bei 37°C und 5% CO2 in einer befeuchteten Kammer gehalten.
Herstellung rekombinanter S-Ectodomain-GFP-Baculoviren
Die Genomsequenzen in voller Länge von 45 SARS-CoV-2-Isolaten wurden analysiert. Die BatCoronavirus-Genom-Annotationen wurden verwendet, um das Spike-Protein auf den Wuhan-CoVs
abzubilden. Für 45 Spike-Proteine wurde ein Multiple Sequence Alignment durchgeführt, und die
Konsensussequenz in voller Länge wurde mit dem Gene Calc-Algorithmus abgeleitet. Die
membranüberspannende Region wurde mit der Software DNAstar Protean identifiziert. Die cDNA
für die Reste 1 bis 1220 der Ektodomäne des SARS-CoV-2-Spike-Proteins (S-Ektodomäne-GFP)
wurde chemisch mit optimalen Kodons für Insektenzellen synthetisiert (Genscript USA Inc, NJ,
USA) und in pVL1393 (Expression Systems, CA, USA) mit einem Sekretionssignal für
Insektenzellen kloniert. Dieses Konstrukt umfasst die vollständigen S1- und S2-Regionen und
endet kurz vor der Transmembranregion (Abbildung S1). Die Furin-Spaltstelle ist von RRAR zu
GSAS mutiert (28). Die TEV-Protease-Spaltstelle (Tobacco Etch Virus) wurde an den C-Terminus
angefügt, gefolgt von einem flexiblen Linker, eGFP und einem 12-fachen Histidin-Tag. Ein
rekombinantes Baculovirus (P0) wurde in SF9-Zellen (Expression Systems, CA, USA) wie im
Protokoll des BestBactm 2.0 Δ v-cath/ChiA Baculovirus Cotransfection Kit (Expression Systems,
CA, USA) beschrieben hergestellt. P1-Baculovirus wurde mit suspendierten Sf9-Zellen (2 ×106
Zellen/ml) mit einer Infektionsmultiplikation (MOI: Anzahl der Viruspartikel/Anzahl der Zellen)
von 0,1 erzeugt. Der Virustiter wurde mit einem durchflusszytometrischen Assay für die gp64-
Expression gemessen (Expression Systems, CA, USA).
Expression und Reinigung des rekombinanten S-Ectodomain-GFP-Proteins
Tni-Zellen (2×106 Zellen/ml), suspendiert in 1 l ESF-AF-Medium, wurden mit dem P1-Virus bei
einer MOI von 5 infiziert. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation
(500×g, 15 Minuten) geerntet. Vor der Zentrifugation wurde eine cOmplete™ ULTRA
Proteaseinhibitor-Tablette (Roche, MA, USA) pro Liter hinzugefügt. Der Überstand wurde durch
Tangentialflussfiltration (TFF) mit einem Pellicon® 2 Mini-Kassetten-System (Millipore, MO, USA)
mit einer Porengröße von 30 kDa konzentriert. Der konzentrierte Überstand wurde auf 40 mM
TRIS-HCl und 1 M Natriumchlorid eingestellt. Dann wurde der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf
8,0 eingestellt und anschließend zentrifugiert (14.500×g, 30 Minuten) und mit einer Thermo
Scientific™ Nalgene™ Rapid-Flow™ 90 mM Filter Unit-1000 ml steril gefiltert. Für die
Affinitätsreinigung wurden 10 ml Ni-Sepharose-Excel-Harz (Cytiva Life Sciences, USA) pro 1 L
Kultur (Vor-TFF-Volumen) zugegeben und über Nacht unter leichtem Rühren bei 4 °C inkubiert.
Das Rühren wurde unterbrochen, damit sich das Harz 1 Stunde lang absetzen konnte.
Anschließend wurde der Überstand dekantiert, das restliche Harz und das Medium wurden gut
gemischt und in eine Schwerkraftflusssäule (Bio-rad, Hercules, CA, USA) gegossen. Die Säulewurde mit 3 Säulenvolumina (CVs) Waschpuffer (40 mM TRIS-HCl pH 8 mit 1M Natriumchlorid),
3 CV Waschpuffer mit 20 mM Imidazol, 3 CV Waschpuffer mit 40 mM Imidazol und schließlich 3
CV Waschpuffer mit 60 mM Imidazol behandelt, bevor die Proteinelution mit 3 CV Waschpuffer
mit 500 mM Imidazol erfolgte. Das S-Ectodomain-GFP-Protein wurde mit einem Amicon® Ultra
15 Zentrifugalfilter (100 kDa MWCO) konzentriert. Es wurde auf eine HiLoad™ 16/600 Superdex™
200 prep grade FPLC-Größenausschlusssäule injiziert, wobei 1x PBS (Fisher scientific, MA, USA)
als Laufpuffer verwendet wurde. Die Peaks wurden mit 1 mL Fraktionen gesammelt. Reine
Fraktionen wurden durch SDS-PAGE identifiziert (MW ~250 kDa), gepoolt und auf 0,5 mg/ml
konzentriert.
Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) basierter hACE2-Bindungstest
Das rekombinante hACE2-AviTag-Protein (Acro Biosystems, DE, USA) wurde auf einem
Sensorchip in den Testflusskanälen eingefangen. Proben von 300 μl frisch hergestellter serieller
Verdünnungen des gereinigten rekombinanten Proteins wurden mit einer Flussrate von 50 μl/min
(Kontaktdauer 180 Sekunden) für die Assoziation injiziert. Die Reaktionen der Proteinoberfläche
wurden um die Reaktionen einer Mock-Oberfläche und um die Reaktionen einer reinen
Pufferinjektion korrigiert. Die gesamte hACE2-Bindung und die Datenanalyse wurden mit der
Bio-Rad ProteOn Manager Software (Version 3.1) berechnet.
Luminex serologischer Assay
Dieser Test wurde mit der gereinigten SARS-CoV-2 S-Ectodomain (5 μg) durchgeführt, die an die
Oberfläche von MagPlex®-Mikrosphären der Gruppe A, Region 43 (Luminex Corp, IL, USA)
gekoppelt war. Die Kopplung der Mikrosphären erfolgte mit dem Luminex xMAP Antibody
Coupling Kit (Luminex Corp, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die
proteingekoppelten Mikrosphären wurden in PBS-TBN-Puffer (1X PBS mit 0,1 % Tween 20, 0,5 %
BSA und 0,1 % Natriumazid) in einer endgültigen Stammkonzentration von 2×106 Mikrosphären
pro ml resuspendiert, wobei 2,5×103 Mikrosphären pro Reaktion verwendet wurden. Die
Serumproben wurden von de-identifizierten COVID-19-Patienten (n=6) und gesunden Spendern
(n=6) am UNMC gewonnen. Fünfzig Mikroliter jeder Serumprobe (1:25 mit 1X PBS-TBN-Puffer
verdünnt) wurden mit 50 μl der S-Ectodomain-gekoppelten Mikrosphären in einer 96-Well-Platte
(Greiner Bio-One) gemischt. Die Testplatte wurde 30 Minuten lang bei 37 °C unter Schütteln bei
700 U/min inkubiert und dann fünfmal mit 1X PBS-TBN-Puffer gewaschen. Dann wurde die Platte
mit Biotin-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG (Abcam, MA, USA), das mit Streptavidin-RPhycoerythrin-Reporter (Luminex xTAG® SA-PE G75) markiert war, 1 Stunde lang bei 25 °C und
Schütteln bei 700 U/min inkubiert. Dann wurde die Platte 5 Mal mit 1X PBS-TBN-Puffer
gewaschen. Schließlich wurde die Platte erneut in 100 μl 1X PBS-TBN-Puffer suspendiert und 10
Minuten lang bei 25 °C und Schütteln bei 700 U/min inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde auf
einem Luminex MAGPIX™ System untersucht, und die Ergebnisse wurden als mediane
Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben.
Bromelain-Behandlung
VeroE6-Zellen wurden in 10% FBS-haltigen Medien gezüchtet und 48 Stunden lang mit Bromelain
(Sigma-Aldrich, MA, USA) in verschiedenen Konzentrationen (19, 37 und 75 μg/ml) behandelt. Für
die zeitabhängige Studie wurden die oben genannten Zellen 0-4 h lang mit Bromelain (75 μg/ml)
unter serumfreien Bedingungen behandelt. Nach Abschluss der Behandlung wurden die Zellen
gewaschen und mit RIPA-Lysepuffer (ThermoFisher, MA, USA), der Proteaseinhibitoren (Roche,
MA, USA) enthält, lysiert. SARS-CoV-2 S-Ectodomain exprimierende TNi-Zellmedien wurden mit
verschiedenen Konzentrationen von Bromelain (5, 10, 15, 20 und 25 μg) für 1 mg Gesamtprotein
bei 37°C für 1h behandelt. Rekombinantes TMPRSS2 (Abnova, CA, USA) wurde bei 37°C für
verschiedene Zeitpunkte (30, 60, 120 und 240 Minuten) mit Bromelain (im Verhältnis 1:1)
behandelt. Für die zeitabhängige Studie wurden die Tni-Medien mit 25 μg Bromelain/mg
Gesamtprotein bei 37 °C für verschiedene Zeitpunkte (30, 60, 120 und 240 Minuten) behandelt.Für den Bromelain-Hitzeinaktivierungstest wurde Bromelain 8 Minuten lang auf 80 °C erhitzt und
dann 30 Minuten lang bei 37 °C mit S-Ectodomain-exprimierendem Tni-Zellüberstand (25 μg
Bromelain/mg Gesamtprotein) behandelt. Für den Test zur Behandlung mit dem
Cysteinproteaseinhibitor (E64) wurde Bromelain plus E-64 (1, 2 und 4 μM) verwendet und mit
dem Überstand von S-Ectodomain-exprimierenden Tni-Zellen (25 μg Bromelain/mg
Gesamtprotein) bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Für die Behandlung mit VeroE6-Zellen wurde
Bromelain (75 μg/ml) plus E-64 (4μM) 2 h lang bei 37°C mit VeroE6-Zellen inkubiert. Am Ende
der Reaktion wurde die Mischung mit 4X-Laemmli-Puffer versetzt und 5 min lang bei 100°C
gekocht. Die Proteinkonzentration im Zelllysat und im Medium wurde mit dem BCA-Kit
(ThermoFisher, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.
SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
Gleiche Konzentrationen von Medien wurden mit 4X-Ladepuffer (Invitrogen, MA, USA) gemischt
und 5 Minuten lang bei 100°C gekocht. Die SDS-PAGE wurde in einem 4-20%igen Gradientengel
(Bio-Rad, CA, USA) durchgeführt. Wir verwendeten SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, MA, USA),
um die Proteinbande im SDS-PAGE-Gel sichtbar zu machen. Das Gelbild wurde mit dem
ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad, CA, USA) aufgenommen. Für den Western Blot wurden
gleiche Konzentrationen von Zelllysat und Medienproteinen auf eine 0,45 μm PVDF-Membran
(Millipore, MA, USA) übertragen. Anschließend wurde die Membran mit 5%igem
Magermilchpulver bei Raumtemperatur für 1 Stunde blockiert und mit dem primären
Zielantikörper in der gewünschten Verdünnung (anti-ACE-2, 1:1000 (Cell signaling technology, MA,
USA); TMPRSS2, 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA); anti-SARS Spike protein 0,05 μg/ml,
(Novus Biologicals, CO, USA)) bei 4°C über Nacht inkubiert. Zur Beladung wurden die
Kontrollmembranen mit Anti-β-Actin- und Anti-GAPDH-Antikörpern (1:5000, Cell Signaling
Technology, MA, USA) getestet. Die Membran wurde mit 1X TBST (3 x 5 min) gewaschen und
dann mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Pferd-Anti-Mäuse 1:2000; Pferd-AntiKaninchen 1:2000, (Cell signaling technology, MA, USA) inkubiert und mit ECLChemilumineszenz-Reagenz (Bio-Rad, CA, USA) entwickelt.
Deglykosylierung der SARS-CoV-2 S-Ectodomäne
Die Entfernung von N-Glykanen, O-Glykanen und Sialinsäuren aus der gereinigten S-Ectodomain
erfolgte mit einem Deglykosylierungskit (Agilent, CA, USA) gemäß den Anweisungen des
Herstellers. Kurz gesagt: 1 μg S-Ectodomain wurde für die Behandlung mit N-Glykanase, OGlykanase und Sialidase A (1 μl/Reaktion) bei 37 °C für 3 h verwendet. Nach der Behandlung
wurden die Protein-Enzym-Gemische mit 2x Laemmli-Puffer gemischt und 5 min bei 100 °C
gekocht und dann mit einem Anti-Spike-Protein-spezifischen Antikörper wie oben beschrieben
immunisiert.
Spike-Protein-Bindungstest
Konfokale Mikroskopie:
VeroE6-Zellen (1 × 105 / Well) wurden auf Deckgläsern in einer 12-Well-Platte ausgesät. Nach 24
Stunden wurden die Zellen 1 Stunde lang in serumfreiem Medium mit 75 μg/ml Bromelain und
Mock (1XPBS) behandelt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 1X PBS gewaschen und 2
Stunden lang mit SARS-CoV-2 S-Ectodomain-GFP (1 μg) in einem serumfreien Medium inkubiert.
Die Zellen wurden gewaschen und 15 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die SpikeProteinbindung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop LSM 800 von Zeiss
(UNMC Core facility) analysiert. Die Inkubation von Zellen mit GFP-His-Tag-Protein (Sino
Biological, PA, USA) diente als Negativkontrolle.Durchflusszytometrie:
VeroE6-Zellen wurden 1 Stunde lang in serumfreiem Medium mit 75 μg/ml Bromelain und Mock
(1XPBS) behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit 2 mM EDTA in PBS abgelöst und
zweimal mit 1X PBS gewaschen. 1 × 106 Zellen wurden mit S-Ectodomain-GFP (1 μg) in einem
serumfreien Medium 2 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in HBSSMedien für die Durchflusszytometrie-Analyse in der UNMC-Kerneinrichtung (BD LSR II
Durchflusszytometer) resuspendiert. Die Ergebnisse wurden mit der Software FlowJo
ausgewertet.
SARS-CoV-2-Infektionstest
VeroE6 (1×104 Zellen) wurden in 96-Well-Platten ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen
gewaschen und mit Bromelain in einem serumfreien Medium behandelt (n=6). Die Inkubation
der Zellen mit PBS diente als Negativkontrolle (n=6). Nach 2 Stunden Behandlung wurden die
Zellen gewaschen und durch serumfreies Medium ersetzt, um eine Infektion mit SARS-CoV-2
(Stamm: BEI_USA-WA1/2020) mit einer Multiplikationsrate (MOI) von 0,01 für 1 Stunde bei 37 °C
durchzuführen. Nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen und durch 5% FBS-haltige
Medien ersetzt. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit 4% gepuffertem
Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences) für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die
fixierten Zellen wurden mit PBS gewaschen und anschließend 15 Minuten lang in einer 0,1%igen
Triton X100-PBS-Lösung permeabilisiert und anschließend in einer 3%igen BSA-PBS-Lösung
blockiert. Die Zellen wurden mit Anti-S-Protein Rab (Sino Biological, PA, USA) im Verhältnis
1:1000 in der Blockierungslösung über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit
einem 1:2000 verdünnten, mit Alexa Fluor 488 konjugierten Sekundärantikörper (Thermo Fisher,
MA, USA) für 1 h bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342 (Thermo Fisher,
MA, USA) gegengefärbt, um die Zellkerne zu erkennen. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem
Nikon Eclipse Ts2R Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Die Gesamtzahl und die Anzahl der
virusinfizierten Zellen wurden mit der Nikon NIS-Elements D Software gezählt.
Statistische Auswertung
Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 8 unter Verwendung eines
zweiseitigen ungepaarten t-Tests durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde bei P <0,05 bestimmt.

• Bromelain hemmt / spaltet die Expression von ACE-2 und TMPRSS2
• Bromelain spaltet/degradiert das SARS-CoV-2-Spike-Protein
• Bromelain hemmt die S-Ectodomain-Bindung und die SARS-CoV-2-Infektion

Leider weiß ich nicht, wie ich dir ein PDF zukommen lassen kann, deshalb der Volltext hier, leider ohne Bilder. Über Telegram wäre das ganz einfach.


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